Diagnóstico Sorológico e Molecular em Doenças das Aves Domésticas

Panorama do diagnóstico aviário

O diagnóstico aviário integra vigilância sanitária, coleta adequada de amostras e escolha criteriosa dos métodos laboratoriais. A aula parte da distinção entre vigilância ativa e passiva e entre diagnóstico direto e indireto, mostrando como o soro, os órgãos e os suabes devem ser conservados e encaminhados. Em seguida, apresenta as principais técnicas sorológicas e moleculares, destacando seus princípios, padrões de leitura, controles e limitações. A interpretação não termina no resultado do exame: um achado sorológico pode refletir vacinação ou contato prévio, enquanto uma PCR exige amostra, extração e controles válidos. Por isso, a conclusão depende da correlação clínica e epidemiológica e das exigências oficiais aplicáveis ao plantel.

Importância sanitária e produtiva

O diagnóstico das doenças infecciosas das aves é fundamental porque essas enfermidades podem comprometer a produção, provocar quedas produtivas e ocasionar prejuízos econômicos e sanitários. Assim, as doenças infecciosas em aves causam problemas na produção avícola.

Algumas doenças não possuem tratamento efetivo e podem disseminar se por todo o plantel, o que exige preparação e vigilância adequadas. Entre as enfermidades de maior relevância estão as doenças de notificação obrigatória, para as quais a legislação determina a realização de vigilância epidemiológica ativa e passiva. A influenza aviária é uma enfermidade exótica de notificação obrigatória em aves.

Vigilância ativa versus passiva

• Vigilância ativa: realizada de maneira programada e periódica, com intervalos específicos para cada doença, como a cada três ou seis meses, ou em outro intervalo específico.
• Objetivo da vigilância ativa: com o objetivo de comprovar que determinado plantel ou território permanece livre da enfermidade.
• Aplicação por espécies: A vigilância ativa é aplicável a várias espécies animais de produção, como bovinos, suínos e aves. Existem programas de vigilância para diferentes espécies, incluindo bovinos, ovinos e aves.
• Vigilância passiva: A vigilância passiva, por sua vez, ocorre quando há uma notificação ou suspeita de doença.

Vigilância dos plantéis reprodutores

Na vigilância epidemiológica, realiza se continuamente o acompanhamento ativo dos plantéis sob investigação. Essa vigilância é especialmente rigorosa nos plantéis de reprodutores, que devem apresentar materiais e resultados de exames ao MAPA com alta frequência.

A exigência se explica porque deles se originam as aves destinadas à produção de frangos de corte e, consequentemente, parte importante dos alimentos consumidos. Nos plantéis de reprodutores avícolas, essa obrigatoriedade inclui a apresentação frequente de exames laboratoriais ao MAPA. Esses plantéis devem demonstrar que estão livres de enfermidades de notificação obrigatória.

Diagnóstico direto versus indireto

A diferença central está no alvo da investigação: a resposta do hospedeiro ou o próprio agente etiológico.

Coleta inicia o diagnóstico

O processo diagnóstico começa na coleta das amostras. Assim, o processo de diagnóstico tem início no campo, com a coleta de amostras biológicas.

1. Etapa: Seguir as orientações do Manual do Programa Nacional de Sanidade Avícola: O material destinado ao laboratório deve seguir as orientações do Manual do Programa Nacional de Sanidade Avícola, que especifica como as amostras devem ser acondicionadas e encaminhadas aos laboratórios de referência.
2. Etapa: Considerar os laboratórios disponíveis: Alguns genótipos e exames também podem ser realizados em laboratórios privados.
3. Etapa: Identificar os materiais: O manual apresenta diferentes tipos de materiais, incluindo órgãos, suabes, ovos, ovos embrionados e ovos não embrionados.
4. Etapa: Ampliar a amostragem quando indicado: A amostragem avícola também pode incluir propés e swabs de chão, além de ovos embrionados e ovos não embrionados.

Materiais biológicos e rastreabilidade

Na etapa de coleta, os principais materiais biológicos são soro, órgãos e suabes. O soro deve ser colocado em frasco separado, devidamente identificado. Como a forma de identificação pode variar entre os laboratórios, é importante entrar em contato previamente com o laboratório responsável para confirmar o sistema utilizado. Alguns estabelecimentos trabalham com números, códigos compartilhados entre o laboratório e o local de coleta ou outras formas específicas de rastreabilidade.

Obtenção e conservação do soro

Para obter o soro, recomenda se encaminhar apenas o soro, sem o coágulo. O sangue pode ser coletado na granja e colocado em tubo seco, aguardando se a separação do soro ou realizando se a centrifugação, quando houver equipamento disponível. Caso não seja centrifugado, o soro pode ser separado posteriormente no laboratório.

Amostras de soro hemolisadas ou alteradas devem ser descartadas na granja, pois são recusadas pelo laboratório de diagnóstico. O congelamento inadequado também pode inutilizar a amostra, que deverá ser descartada porque o laboratório provavelmente não conseguirá utilizá la.

Pools de órgãos por sistema

Os órgãos devem ser enviados em pools formados por materiais pertencentes ao mesmo sistema. Amostras de órgãos pertencentes ao mesmo sistema orgânico podem ser reunidas e enviadas em um mesmo pool. No sistema respiratório, a traqueia e o pulmão devem ser colocados no mesmo recipiente.

Não é necessário enviar o órgão inteiro; podem ser encaminhados fragmentos de aproximadamente dois a três centímetros, conforme as recomendações do manual. Fragmentos de órgãos de aves também podem ser agrupados em pool para a realização de análises laboratoriais.

Pools de suabes e padronização

Os suabes também devem ser enviados em pools. A quantidade de suabes permitida em cada pool é padronizada conforme o tipo e o sítio anatômico de coleta do suabe. O suabe cloacal possui uma quantidade específica permitida em cada pool. O suabe traqueal possui uma quantidade específica permitida em cada pool, assim como o suabe de secreção oral. O manual descreve quantos suabes de cada tipo podem ser reunidos no mesmo pool e como o material deve ser preparado para o encaminhamento.

Materiais complementares de coleta

Também existe material elaborado pelo MAPA e pela Organização Pan Americana da Saúde sobre coleta de amostras. O material técnico, elaborado pelo MAPA em parceria com a OPAS, aborda procedimentos de coleta de amostras biológicas.

Embora seja mais antigo, o documento é bastante didático, contém muitas imagens e aborda diferentes espécies. A coleta de sangue em aves pode ser realizada por sangria. Em aves, a coleta de sangue pode ser realizada por punção da veia da asa. O conteúdo também inclui orientações sobre outros procedimentos, materiais e vias de coleta.

Reação antígeno anticorpo nas aves

O diagnóstico sorológico geralmente pesquisa uma reação entre antígeno e anticorpo, representando a resposta do hospedeiro ao agente investigado. Assim, o diagnóstico sorológico baseia se na detecção de reações antígeno anticorpo.

Nas aves, não se utiliza a nomenclatura de imunoglobulinas da mesma forma empregada em outras espécies; as aves produzem imunoglobulinas próprias. As aves não produzem imunoglobulina da classe IgG típica dos mamíferos, mas produzem a imunoglobulina IgY. Essa distinção é importante porque cada teste pode mensurar uma imunoglobulina diferente. Portanto, ao escolher um teste sorológico, é necessário considerar sua sensibilidade para a imunoglobulina aviária que será detectada.

Aglutinação na rotina avícola

No teste de aglutinação, determinados anticorpos reconhecem antígenos específicos e produzem a formação de grumos quando ambos são colocados em contato. Na avicultura, essa técnica é utilizada principalmente para bactérias e pode ser empregada no diagnóstico de Salmonella.

A prova de aglutinação pode ser executada a partir de colônias bacterianas de Salmonella isoladas de amostras de propé de granja, e os testes de aglutinação são frequentemente utilizados no diagnóstico de micoplasmoses em aves. Quando a reação é positiva, formam se grumos visíveis. A reação ocorre rapidamente em uma placa, geralmente em aproximadamente três minutos, e deve ser comparada com um controle positivo.

Leitura e controles da aglutinação

Para homogeneizar a mistura, realiza se um movimento circular cuidadoso. O controle positivo deve apresentar aglutinação, servindo como referência para a interpretação das amostras. Além disso, nos controles positivos do teste de aglutinação, todas as amostras devem apresentar aglutinação.

A formação de grumos indica que a reação ocorreu. A técnica é qualitativa: permite verificar a presença ou ausência da reação, mas não determina a quantidade de antígeno ou anticorpo presente na amostra.

IDGA: poços e precipitação

A imunodifusão em gel de ágar (IDGA) utiliza uma placa contendo gel e pequenos poços. No poço central é colocado o antígeno, enquanto os demais recebem um controle positivo e as amostras a serem testadas.

Quando há reação positiva, ocorre a formação de uma linha de precipitação entre o poço da amostra e o sistema de referência. O controle positivo deve apresentar essa linha para confirmar a validade do teste. A técnica de imunodifusão em gel de ágar (IDGA) continua sendo utilizada devido ao seu baixo custo operacional e à simplicidade de execução.

Leitura da reação na IDGA

Na IDGA, o gel é preparado em uma placa pequena e os poços são perfurados para receber o material. Após a preparação, o material permanece em desenvolvimento por aproximadamente 48 horas antes da leitura.

Na interpretação, uma amostra negativa não forma a linha de precipitação correspondente. A reação pode permanecer restrita ao poço ou apresentar um padrão diferente daquele observado nas amostras positivas. A técnica é utilizada na avicultura e em outros diagnósticos.

Limites dos testes qualitativos

A aglutinação e a IDGA são exames predominantemente qualitativos: permitem determinar se existe ou não uma reação, mas não mensuram a quantidade de antígeno ou de anticorpo presente.

Essa limitação as diferencia de métodos capazes de fornecer resultados quantitativos ou semiquantitativos, como algumas modalidades de ELISA e determinados testes moleculares.

Rede viral com hemácias

Na hemaglutinação, o vírus apresenta estruturas denominadas hemaglutininas. Essas estruturas reconhecem hemácias e se ligam a várias células ao mesmo tempo, formando uma rede ou aglomerado.

A ligação de partículas virais a múltiplas hemácias pelas hemaglutininas forma uma rede que resulta em aglomeração celular, denominada hemaglutinação. O resultado visual é semelhante à aglutinação, mas a formação do aglomerado é provocada pela interação do vírus com as hemácias.

Diluições definem o resultado

A leitura do teste depende da relação entre a diluição da amostra e a persistência da inibição da hemaglutinação.

A série de diluições permite estimar a quantidade relativa de componentes presentes na amostra.

ELISA em larga escala

O ELISA é uma das principais técnicas sorológicas e possui ampla aplicação em diferentes diagnósticos, espécies e áreas. É utilizado em animais de pequeno e grande porte e também em seres humanos. A sigla ELISA provém do inglês e traduz se em português como ensaio imunoenzimático (imunoensaio).

A técnica apresenta custo relativamente baixo e permite testar várias amostras simultaneamente em placas com 96 poços. Cada placa de ELISA possui 96 poços, possibilitando a testagem de até 96 amostras em uma única corrida.

Após a introdução e implementação do teste ELISA, a rotina de diagnóstico sorológico concentrou se predominantemente nessa técnica. Na avicultura, é empregada para avaliar a resposta vacinal, verificar a imunidade geral do plantel e auxiliar no planejamento de novos protocolos de vacinação. O teste de ELISA pode ser utilizado para detectar anticorpos contra a doença de Gumboro nas aves.

Aplicações e modalidades do ELISA

Além da investigação de resposta vacinal, o ELISA pode ser utilizado para pesquisar hormônios, inflamação e diversos outros alvos. Existem quatro modalidades principais de ELISA, amplamente empregadas nos diagnósticos.

Entre elas, o ELISA indireto é uma das formas mais utilizadas na rotina da avicultura. Na avicultura, o método de ELISA indireto é utilizado com maior frequência por ser mais específico que o direto.

Etapas do ELISA indireto

No ELISA indireto, o antígeno correspondente ao agente pesquisado está previamente ligado à superfície do poço. A amostra é adicionada e pode ou não conter anticorpos contra esse antígeno. Se os anticorpos estiverem presentes, eles se ligam ao antígeno fixado.

Em seguida, adiciona se um segundo anticorpo, dirigido contra o anticorpo da amostra, e ligado a uma enzima. O teste é denominado imunoensaio porque envolve a interação específica entre antígeno e anticorpo.

Cor indica a reação enzimática

Na terceira etapa da reação de ELISA, adiciona se um substrato específico para a enzima conjugada ao anticorpo secundário. Se todas as ligações anteriores tiverem ocorrido, a enzima reagirá com o substrato e produzirá alteração de cor. A presença de cor indica resultado positivo.

Quando não há anticorpos na amostra, o segundo anticorpo não permanece ligado e a enzima não consegue produzir a reação de cor, caracterizando resultado negativo.

Quantificação pela intensidade cromática

O ELISA também pode fornecer resultado quantitativo ou semiquantitativo. A intensidade da cor é medida por um equipamento que avalia a reação óptica; essa mensuração pode ser realizada por meio de um espectrofotômetro. Quanto mais intensa a cor, maior tende a ser o número registrado pelo leitor e maior a quantidade relativa de anticorpos ligados.

A cor pode ser azul, amarela ou roxa, dependendo do kit utilizado. A interpretação final depende do diagnóstico, do produto, do agente pesquisado e das instruções do kit.

Critérios de leitura do ELISA

• Resultado direto ou calculado: Alguns kits fornecem o resultado diretamente, enquanto outros exigem cálculos específicos.
• Relação amostra controle: Em determinados testes, utiliza se uma relação entre valores da amostra e controles; em outros, essa relação não é necessária.
• Séries de diluição: Também podem ser empregadas séries de diluição.
• Critério de avaliação: A avaliação quantitativa depende das características do teste utilizado e dos critérios definidos para aquele agente.

ELISA sanduíche e especificidade

No ELISA sanduíche, a placa já apresenta um anticorpo fixado, em vez de um antígeno. O antígeno presente na amostra liga se a esse anticorpo; depois, um segundo anticorpo ligado a uma enzima reconhece o antígeno.

O antígeno fica entre dois anticorpos, justificando a denominação “sanduíche”. Essa configuração é mais específica do que o ELISA indireto. O ELISA sanduíche e o ELISA de competição constituem outras duas variantes da técnica de ELISA.

Competição reduz a intensidade cromática

O ELISA de competição utiliza um antígeno fixado no poço e recebe simultaneamente a amostra e um componente marcado ligado ao anticorpo. Nos ensaios imunoenzimáticos de competição, ocorre uma disputa entre antígenos ou anticorpos para a ligação aos sítios reagentes. Se a amostra contiver anticorpos, eles competirão pela ligação ao antígeno.

Quanto mais anticorpos estiverem presentes na amostra, menor será a ligação do componente marcado e menor será a intensidade da reação de cor. Assim, a ausência ou redução da cor pode indicar resultado positivo, enquanto a presença de cor pode indicar resultado negativo. O ELISA de competição permite quantificar as reações antígeno anticorpo presentes na amostra.

Fluorescência direta no antígeno

Na imunofluorescência, o marcador utilizado é uma substância fluorescente, e não uma enzima. A reação é observada com o auxílio de um microscópio de fluorescência, em uma lógica geral semelhante à do ELISA.

Existem modalidades direta e indireta. Na imunofluorescência direta, o anticorpo já está ligado à substância fluorescente e, ao reconhecer o antígeno, produz fluorescência visível.

Fluorescência indireta em sequência

Na imunofluorescência indireta, o primeiro anticorpo liga se ao antígeno, mas não possui diretamente o marcador fluorescente. Um segundo anticorpo, ligado à substância fluorescente, reconhece o primeiro anticorpo. A fluorescência somente será observada quando essa sequência de ligações tiver sido estabelecida.

Complemento como sistema indicador

A fixação do complemento utiliza sangue para evidenciar a reação. O sistema complemento é constituído por um conjunto de diversas proteínas e substâncias séricas e participa da reação quando há ligação entre antígeno e anticorpo. Se essa ligação ocorrer, o complemento será fixado, ou seja, ficará ligado ao complexo antígeno anticorpo e não estará disponível para atuar sobre a hemolisina.

Em uma segunda etapa, adicionam se hemácias e hemolisina. As hemácias (sangue) atuam como sistema indicador para a visualização da reação.

Hemólise versus hemácias íntegras

A interpretação da fixação do complemento depende de o complemento ser fixado pelo complexo antígeno anticorpo ou permanecer disponível para se ligar à hemolisina.

A técnica é atualmente menos utilizada, especialmente após a implementação do ELISA, devido ao custo operacional e à maior facilidade de execução de outras metodologias. A IDGA ainda continua sendo empregada em algumas situações.

Radiação na reação sorológica

O radioimunoensaio é uma metodologia diagnóstica pertencente ao grupo das técnicas sorológicas, baseada na ligação entre antígeno e anticorpo. Em vez de uma enzima ou de uma substância fluorescente, utiliza um marcador radioativo: emprega se radiação, que é medida por um equipamento específico. Quanto maior a radiação detectada, maior é a quantidade relativa da reação entre antígeno e anticorpo, conforme o sistema utilizado.

Leitura integrada do plantel

O resultado sorológico deve ser relacionado à situação do plantel, aos sinais clínicos observados nas aves e às demais informações epidemiológicas. O teste fornece um número ou um indicativo, mas não determina sozinho o que está ocorrendo. A conclusão exige a análise conjunta dos resultados laboratoriais, do histórico, das manifestações clínicas e das condições observadas na granja.

Janela imunológica limita conclusões

A janela imunológica limita a interpretação de uma sorologia negativa. A infecção pode ter ocorrido recentemente, sem que o animal já tenha produzido anticorpos detectáveis. Em doenças muito agudas, a ave pode morrer antes de desenvolver uma resposta sorológica suficientemente intensa.

Por outro lado, em algumas enfermidades, a produção de anticorpos pode demorar. Assim, uma sorologia negativa não exclui necessariamente uma infecção recente.

Confirmação seriada e molecular

O resultado sorológico pode precisar ser comparado com uma técnica molecular ou com dois resultados diferentes, incluindo avaliações realizadas por ELISA. Essa confirmação por diferentes métodos ajuda a sustentar a interpretação em situações específicas.

Em situações relacionadas a doenças de notificação obrigatória, podem ser exigidas amostras seriadas em intervalos de sete dias. A confirmação da ausência da enfermidade deve ser obtida em todas as avaliações exigidas antes da liberação da certificação de plantel livre.

Diagnóstico molecular busca o agente

O diagnóstico molecular procura diretamente o agente infeccioso ou o material genético correspondente, identificando uma sequência específica de DNA ou RNA em vez de buscar a resposta imunológica do hospedeiro. Assim, o diagnóstico molecular constitui um método de diagnóstico direto, voltado à identificação direta do patógeno ou de seu material genético. Entre as principais metodologias, destaca se a reação em cadeia da polimerase (PCR), apresentada em diferentes modalidades. No diagnóstico molecular avícola, a reação em cadeia da polimerase (PCR) é a técnica aplicada.

Transcrição reversa do RNA

A transcrição reversa é realizada no diagnóstico de vírus que possuem genoma de RNA. Para a detecção de vírus de RNA por PCR, é necessário converter o RNA em DNA para que a amplificação ocorra. Por isso, a mistura reacional para a realização de RT PCR necessita da enzima transcriptase reversa. Antes do início dos ciclos de amplificação na RT PCR, a enzima transcriptase reversa converte o RNA viral em DNA complementar (cDNA). A reação de amplificação da RT PCR desenvolve se a partir da molécula de DNA complementar gerada.

Desnaturação no termociclador

Na técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), a etapa de desnaturação do DNA ocorre sob temperaturas bastante elevadas. As duas fitas do DNA se separam e permanecem disponíveis para as etapas seguintes. A reação ocorre dentro de um equipamento denominado termociclador, que alterna as temperaturas necessárias para que o material genético seja desnaturado, reconhecido e novamente sintetizado. O termociclador é o equipamento responsável por aumentar e controlar a temperatura para que ocorra a reação de PCR.

Primers reconhecem sequências específicas

Os iniciadores ou primers são reagentes essenciais adicionados à mistura da PCR. Cada primer é um segmento de sequência conhecida correspondente ao DNA ou RNA do patógeno pesquisado, desenhado para reconhecer uma região específica desse material genético.

Depois da desnaturação, o primer se liga à região complementar que reconhece. Em seguida, a DNA polimerase utiliza essa ligação como ponto de início para construir uma nova fita de DNA, permitindo que a sequência alvo seja amplificada.

Ciclos ampliam o alvo genético

Na PCR, a sequência de desnaturação, ligação do primer e síntese do DNA repete se diversas vezes. O número de ciclos depende do agente e do protocolo utilizado: alguns protocolos usam aproximadamente 40 ciclos, enquanto outros utilizam 45.

A cada ciclo, a quantidade do segmento de DNA é aproximadamente duplicada. Assim, uma quantidade inicial correspondente a um segmento pode transformar se em grande quantidade de material amplificado ao final da reação.

Ladder orienta a leitura

A leitura do resultado é feita comparando as bandas da amostra com o marcador molecular ladder, ou escada molecular, que funciona como controle de referência de tamanho em pares de bases e contém bandas de tamanhos conhecidos. As bandas mais evidentes no gel de eletroforese correspondem ao tamanho molecular em pares de bases da amostra analisada. Se o agente apresentar, por exemplo, um produto esperado de 500 pares de bases, as amostras que apresentarem uma banda nessa posição serão consideradas positivas; cada poço pode corresponder à amostra de um animal diferente.

Limitações da leitura visual

A PCR convencional fornece um resultado qualitativo: indica apenas se houve ou não amplificação na posição esperada, sem informar a quantidade de material presente na amostra. Por isso, a intensidade da banda não fornece uma quantificação confiável, e a técnica não apresenta uma curva ou um número objetivo que indique essa quantidade, dependendo principalmente da avaliação visual. Manchas ou alterações no gel podem dificultar a leitura e gerar interpretações equivocadas.

Uso atual da PCR convencional

A PCR convencional é considerada mais limitada e vem sendo substituída em muitos diagnósticos pela PCR em tempo real. Mesmo assim, ainda pode funcionar adequadamente em algumas aplicações, como determinados exames para hemoparasitas. Para diversos agentes, a PCR em tempo real oferece maior praticidade e melhor capacidade de interpretação.

Duas rodadas de amplificação

A PCR nested (PCR aninhada) é semelhante à PCR convencional, mas utiliza duas etapas de amplificação e baseia se nos mesmos princípios da PCR convencional. Todas as variações de PCR operam com base no mesmo princípio de multiplicação de material genético.

Inicialmente, realiza se uma PCR. O produto amplificado é então utilizado como molde para uma segunda PCR, como se fosse realizada uma PCR do produto da primeira PCR. O material final da segunda reação é aplicado no gel para análise, e o produto final gerado na nested PCR fica superamplificado.

Detecção ampliada e contaminação

A nested PCR pode ser utilizada quando a quantidade inicial de material é muito baixa ou quando a reação é pouco específica. Nessa situação, é indicada para contornar reações inespecíficas, garantindo maior quantidade de material genético para assegurar a amplificação. A segunda amplificação aumenta a quantidade de material genético disponível e pode facilitar a detecção.

Há, porém, um custo: se a primeira PCR apresentar contaminação, a segunda etapa também amplificará esse material. Dessa maneira, a PCR nested pode aumentar a contaminação e a ocorrência de reações inespecíficas, razão pela qual seu uso é ainda mais restrito. Por isso, a nested PCR é menos utilizada na rotina do que a PCR convencional.

Princípio e siglas da qPCR

A PCR em tempo real, ou qPCR, acompanha a multiplicação do material genético durante os ciclos por meio de um termociclador acoplado a softwares e sistemas que exibem o resultado em curvas. Por isso, não é necessário realizar posteriormente a eletroforese em gel de agarose.

Entre as modalidades estão a PCR convencional, a RT PCR e a qPCR. Na sigla RT PCR, RT significa transcrição reversa, e não tempo real; portanto, RT PCR não deve ser confundida com Real Time PCR. A letra q indica que a PCR em tempo real é quantitativa.

Leitura e validade das curvas

A PCR em tempo real é mais específica e depende de um padrão específico de curva para que a amplificação seja considerada válida. No gráfico, o eixo horizontal inferior representa os ciclos térmicos de amplificação, enquanto perfis de curva desordenados ou fora do padrão esperado indicam resultado negativo.

A posição inicial da curva também orienta a interpretação: uma amplificação precoce em ciclos baixos, como no ciclo 14, indica carga inicial altíssima de material genético. O threshold é a linha de corte a partir da qual a fluorescência passa a ser detectada e validada, e o diagnóstico molecular por PCR em tempo real pode fornecer resultados em cerca de duas horas.

Aplicação prognóstica da qPCR

Na rotina de pequenos animais, qPCRs seriados para FeLV são utilizados como ferramenta de prognóstico: um menor número de ciclos de detecção corresponde a uma maior carga viral no organismo do gato. Assim, a leitura repetida dos ciclos ajuda a acompanhar a situação viral.

A leucemia viral felina é uma enfermidade sem cura que persiste por toda a vida do gato, e a PCR seriada ajuda a avaliar o prognóstico e a persistência viral.

Posição da curva e carga

Quantidade inicial de material genético

Quanto mais à esquerda a curva se inicia, menor é o número de ciclos necessário para detectar a amplificação e maior tende a ser a quantidade inicial de material genético. Quando a curva começa mais à direita, é necessário um número maior de ciclos para atingir a detecção, indicando menor quantidade inicial.

Uma amostra cuja curva somente se torna detectável por volta do ciclo 35 apresenta menos material inicial do que outra detectada em ciclos anteriores.

Concentração limita os reagentes

Na PCR, o resultado depende da quantidade de ciclos e da quantidade de material adicionada à reação. Como os primers são colocados em concentração determinada, uma amostra com material muito abundante pode consumir os componentes da reação antes que toda a amplificação esperada seja observada. Quando reagentes limitantes, como os primers, se esgotam, a amplificação cessa; por isso, é necessário conhecer a quantidade adequada de cada componente do ensaio.

Múltiplos agentes na mesma reação

Na PCR multiplex, são utilizados vários primers em uma única reação. Em vez de investigar apenas um segmento conhecido, a técnica permite pesquisar diferentes agentes simultaneamente na mesma amostra, o que é útil quando há suspeita de mais de um agente infeccioso ou quando diferentes agentes produzem manifestações clínicas semelhantes.

Assim, o ensaio pode identificar simultaneamente diversos patógenos, como Erliquia, Anaplasma e Rickettsia, com economia de tempo e custos.

Economia de tempo na multiplex

A multiplex pode reduzir custos e economizar tempo porque vários alvos são avaliados em uma única reação. Uma reação de PCR pode durar aproximadamente duas horas e produzir o resultado nesse intervalo.

Na PCR convencional, além da amplificação, é necessário preparar o gel, aplicar o produto e aguardar a eletroforese, tornando o processo mais demorado e podendo levar o resultado para o mesmo dia. Essa etapa de eletroforese em gel acrescenta cerca de duas horas adicionais para a visualização dos resultados.

Alvos aviários em conjunto

A técnica pode ser utilizada para pesquisar simultaneamente agentes como Ehrlichia e Anaplasma, entre outros. Em aves, também pode ser aplicada à investigação conjunta de diferentes agentes respiratórios, integrando o diagnóstico de patógenos aviários em uma mesma abordagem.

Há protocolos desenvolvidos para detectar, em uma única reação, dois agentes associados a enfermidades aviárias, e essa estratégia pode ser ajustada conforme os alvos de interesse. Essa abordagem permite integrar o diagnóstico de diferentes patógenos aviários, como Influenza Aviária e Doença de Newcastle, em um único protocolo de PCR multiplex.

Beta actina valida a extração

Use o controle interno para verificar se a amostra contém material celular e se a extração permitiu validar a corrida de PCR.

1. Etapa: Identifique a beta actina como controle interno da reação molecular.
2. Etapa: Reconheça que, como gene constitutivo endógeno, a beta actina é empregada como alvo interno por estar presente em todas as células de aves e mamíferos.
3. Etapa: Considere que a beta actina é uma molécula endógena presente nas células dos animais.
4. Etapa: Verifique a detecção da beta actina. A detecção da beta actina demonstra que havia material celular na amostra e que a extração foi realizada adequadamente.
5. Etapa: Confirme a formação da curva de amplificação. A formação dessa curva durante a corrida é necessária para comprovar o sucesso do teste.
6. Etapa: Valide o funcionamento da reação somente quando houver detecção e formação da curva da beta actina. A detecção e a formação da curva da beta actina são necessárias para validar o funcionamento da reação.
7. Etapa: Se o controle interno não produzir uma curva, não interprete com segurança o resultado negativo para o agente pesquisado.
8. Etapa: Se houver ausência de amplificação da curva de beta actina, invalide a corrida de PCR, pois a ausência de amplificação da curva de beta actina invalida a corrida de PCR e indica falha técnica na reação.

Controles positivo e negativo

Na PCR convencional, é importante utilizar o controle positivo. Ele deve apresentar resultado positivo para confirmar que os reagentes e as condições da reação funcionaram. O controle negativo, por sua vez, deve permanecer sem amplificação.

Na rotina de PCR, os controles positivo e negativo são inseridos na mesma placa de teste. Se o controle negativo apresentar sinal, pode ter ocorrido contaminação; nesse caso, a corrida não deverá ser considerada válida.

Escolha do material biológico

A PCR permite utilizar maior variedade de amostras do que muitas técnicas sorológicas, que utilizam apenas soro. Para a coleta de amostras destinadas à PCR em aves, utilizam se frequentemente suabes traqueais e cloacais, além de órgãos e, em determinadas situações, sangue total. A escolha depende da doença investigada e do local em que o agente provavelmente estará presente.

Tropismo orienta órgãos coletados

A coleta deve considerar o tropismo e o sistema relacionado à enfermidade. Para doenças respiratórias, como Newcastle e influenza aviária, a coleta de órgãos pode incluir pulmão e traqueia. Não é necessário coletar intestino ou coração quando esses órgãos não correspondem ao sistema investigado. Se a finalidade for investigar uma doença sistêmica, a escolha dos materiais deverá ser diferente.

Sangue total versus soro

Em alguns casos, utiliza se sangue total, pois a PCR necessita de células quando o alvo está associado ao material celular. O soro, por não conter células em condições habituais, pode não ser o material mais adequado para determinados alvos moleculares. Por isso, para a PCR, utiliza se sangue total em vez de soro, pois o soro é acelular e o exame necessita de células para a obtenção do DNA. Cada tipo de material exige um procedimento de extração de DNA específico.

Extração condiciona a PCR

A extração é uma das limitações da PCR. Na maioria das vezes, trata se de um processo manual realizado em numerosas amostras, e a qualidade da reação depende diretamente de uma extração bem executada. O controle interno, como a beta actina, auxilia na verificação de que o material genético foi efetivamente extraído e estava disponível para a amplificação.

Quantificação por cópias de DNA

A PCR digital é uma modalidade de PCR em tempo real que fornece uma estimativa mais exata do número de cópias de DNA presentes na amostra. Essa modalidade realiza a quantificação exata do número de cópias de DNA presentes na amostra. Enquanto a PCR em tempo real informa principalmente o ciclo em que a reação foi detectada, a PCR digital permite expressar o resultado em cópias de material genético. É uma técnica útil, mas ainda pouco utilizada na rotina.

Manual oficial por doença

O MAPA disponibiliza um manual de diagnóstico oficial organizado por doença, contemplando diferentes espécies animais e outras áreas de interesse sanitário. Há uma seção específica para aves, na qual são descritos os procedimentos oficiais que devem ser realizados para diferentes enfermidades.

Conteúdo técnico do manual

Ao consultar a seção referente à influenza aviária, por exemplo, o manual apresenta possibilidades diagnósticas como inibição da hemaglutinação, PCR e ELISA, além de orientar como cada exame deve ser realizado. O documento especifica os primers, reagentes, tipos de amostra e procedimentos de coleta ou processamento necessários para cada enfermidade.

Diretrizes oficiais para consulta

O manual reúne informações sobre outros procedimentos além do diagnóstico e está disponível para consulta pública. Os manuais de diagnóstico oficiais do MAPA são fundamentados nas diretrizes da Organização Mundial de Saúde Animal (OMSA). Essa consulta ajuda a compreender as exigências aplicáveis aos exames sanitários e a conhecer os procedimentos de forma sistematizada.